優(yōu)化ELISA的技巧

更新時間：2025-02-10

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1. 選擇合適的ELISA格式

由于ELISA的設(shè)計非常靈活，因此可以根據(jù)實驗需求進行合適的格式選擇。最好使用簡單的ELISA格式，這樣對成本控制更有利；但是同樣的，還需要考慮特異性、干擾等問題。例如，如果是篩選合適的單抗，那么簡單的直接或間接ELISA比較合適；如果是在復(fù)雜基質(zhì)中特異性檢測目標(biāo)待測物時，則夾心ELISA是好的選擇。如果是檢測一些分子量較小，同時關(guān)鍵試劑不好獲得時，競爭ELISA則是更好的選擇。

2. 選擇合適的包被表面（板）

由聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的平底96孔板用于絕大多數(shù)ELISA分析。使用專為ELISA設(shè)計的板非常重要，因為它們的制造是為了保持一致性、最大限度地減少邊緣效應(yīng)并為數(shù)據(jù)收集提供最佳光學(xué)條件。最好選擇值得信賴的廠家，或?qū)τ谝恍┖牟奶峁┥痰漠a(chǎn)品進行產(chǎn)品性能確認，通過對同意樣品標(biāo)準(zhǔn)化操作，然后比較批內(nèi)和批間各個孔的信號差異，盡量控制到5%以下。

值得注意的是，一些酶法在催化底物時，產(chǎn)生的是熒光或者化學(xué)信號，這時候可能需要選擇一些不透明的板，防止熒光透射到其它孔徑中干擾檢測。

除了考慮到均一性等性能外，還要考慮板的包被載量和結(jié)合特性。

關(guān)于結(jié)合特性，可能是在包被一些特殊蛋白時需考量。如：因通常ELISA包被是利用疏水作用等物理特性包被的，當(dāng)需要包被的蛋白太小且大部分氨基酸都是親水氨基酸時，常規(guī)的包被方式就不合適，這時候其實也可以更管合適的ELISA板，如處理后的親水表面ELISA板。

3. 選擇合適的包被方式

選擇合適的包被方式包被主要要考慮的是包被液、溫度、濃度、時間等條件。常見的包被液有碳酸鹽緩沖液（CBS）和磷酸鹽緩沖液（PBS）。CBS pH值在9.6左右，呈弱堿性；PBS pH值在7.4左右，偏中性。包被的蛋白可能會因為一些氨基酸、等電點的原因，導(dǎo)致在堿性條件下包被不理想，可以嘗試不同類型的包被液。

包被溫度一般有4℃、室溫、37℃等條件。一般包被溫度和包被時間相配合。一般包被4℃和室溫都是過夜包被，而37℃通常2小時左右就可以了。但是一般4℃和室溫過夜包被更加穩(wěn)定充分，且對蛋白保護較好，37℃可能一些蛋白不太穩(wěn)定，包被均一性可能也有些不確定，在條件允許下，推薦過夜包被。包被濃度的選擇一般和板載量和測量格式的適配程度相關(guān)，一般通過棋盤進行確認和選擇，將會在棋盤條目進行闡述。值得注意的是，一些小蛋白如多肽很難包被，這是可選擇對其進行蛋白偶聯(lián)，常見的偶聯(lián)物有BSA、KLH、OVA等。

4. 選擇合適的封閉液

封閉液的選擇關(guān)乎到ELISA的整體性能，封閉的目的是包被完成后，將空白位置填補上，防止后續(xù)步驟中的任何非目標(biāo)結(jié)合的蛋白結(jié)合到板子上，造成干擾和背景信號異常。通常的封閉液都是一些無關(guān)蛋白，如BSA、動物血清、脫脂奶粉、酪蛋白等。目前也有一些針對特殊需求的非蛋白封閉劑。當(dāng)你在進行ELISA檢測無論如何進行試劑濃度調(diào)整，發(fā)現(xiàn)背景信號都很異常時，可能就是封閉液選擇不對，就需要分析可能的原因。如封閉液BSA較大，在一些特殊條件下可能不能填補非特異結(jié)合的無關(guān)蛋白的結(jié)合位置，這時候就需要更換成酪蛋白等較小的封閉試劑等。